作者解读丨内蒙古农大张和平教授团队: 母乳源益生菌Probio-M8可通过哺乳经口腔/肠道-乳腺轴垂直传递到婴儿肠道(国人佳作)
母体摄入少量的细菌能通过口腔-肠道-乳腺途径转移到婴儿肠道，这表明通过哺乳用双歧杆菌和其他益生菌喂养婴儿是可行的。
以往大多数证明母婴菌群传播现象的研究都是观察性的，仅在属或种水平下进行，并且完全依赖基于非培养的方法，这些问题阻碍了针对婴儿肠道菌群靶向调节其生理及健康的策略。本研究旨在利用生物标记菌株乳双歧杆菌Probio‑M8 (Bifidobacterium animalis subsp. lactisProbio-M8，简称Probio-M8)，通过综合培养依赖/独立的方法直接评估母体摄入益生菌的垂直传递。本研究的培养和宏基因组学结果显示，少量母体摄入的益生菌可以在哺乳期通过口腔-肠道-乳腺途径转移到婴儿的肠道。与非突变菌株相比，母婴分离株的Probio-M8同源株在一个编码葡萄糖转运蛋白的glcU基因上发生高频突变以及碳水化合物利用偏好和能力的改变，表明Probio-M8经历了适应性进化，以便在单糖剥夺下的肠道环境中更好地生存。本研究采用培养和非培养技术相结合的方法证实了母乳源益生菌Probio-M8能够最终靠肠道-乳腺途径转移到婴儿肠道，不仅在菌株水平证实了母婴间细菌的垂直传递，也为婴儿早期益生菌的补充提供了新策略。
译名：乳双歧杆菌Probio-M8通过glcU突变进行宿主适应性进化，并在哺乳期借助口腔/肠道-乳腺途径转移到婴儿肠道
本研究共招募了11对哺乳期的健康母婴(补充表1)，在试验期间哺乳期母亲每天摄入单独包装的M8菌粉(每天一袋，含6×1010 CFU)。M8干预开始后，每周连续收集母乳1-2次，共8-15周(补充表1)。将每周的新鲜粪便(10-15 g)收集到50 ml无菌取样管中，然后进行DNA提取和宏基因组测序。将母乳样品和粪便样本在37°C下厌氧孵育72 h，通过纯度条纹分离具有乳双歧杆菌形态特征的菌落，并在液体培养基中培养。使用TIANamp细菌DNA试剂盒提取总DNA，用纳米滴分光光度计检测提取的DNA的浓度和纯度。将纯化后的DNA(50 μL)稀释至100 ng/μL，然后进行16S rDNA扩增，利用NCBI的blassof进行序列同源性比对搜索，以确定每个分离株的身份。在Illumina HiSeq平台上对所有乳双歧杆菌的全基因组进行深度测序，并构建核心基因组和系统发育树，进行基因组结构变异的识别和突变的框定，鉴定出M8同源株的基因组结构变异，然后采用表型微阵列(PM)技术分析菌株的碳源利用偏好和能力。
婴儿肠道菌群在免疫、代谢和神经系统的发育中起着重要作用，然而婴儿肠道菌群的形成和导致个体差异的因素仍不完全清楚。针对母亲和婴儿之间的自然关系，母亲的肠道、皮肤、和唾液中的菌群被认为是婴儿菌群的主要来源，但在何时和以什么方式转移到婴儿的菌群仍有许多争议。最近的报告显示，细菌存在于母亲的胎盘、脐带和羊水中，这说明婴儿肠道菌群可能在分娩前就已经存在，但这一假设仍存在争议。此外，许多围产期条件如分娩方式、喂养类型和抗生素的使用，也可能影响婴儿的肠道菌群。然而人们普遍认为，婴儿的肠道菌群直到三岁时才变得成熟，因此，抓住规划肠道菌群的机会，特别是通过母亲的饮食和哺乳是至关重要的。 据报道，肠道菌群可以通过哺乳期从母亲垂直传递给婴儿，但大多数研究都是观察性的，这些研究仅限于属或种水平。此外，由于肠道、和母乳中的菌群之间存在大量重叠，在属和种水平上产生的研究结果缺乏特异性。这样一些问题阻碍了对婴儿肠道菌群目标调节策略的准确解释和进一步发展，尽管最近宏基因组技术的发展为研究调查母婴细菌传播设计深度测序提供进一步观察证据，仍然有必要通过整合功能分析(如实验室培养、分离和特定菌株的生化特征)来充分验证宏基因组的结果。 这项工作的目的是在哺乳期间通过母亲摄入益生菌为母婴垂直传递提供直接证据，选择生物标记菌株M8来跟踪通过母乳进行的母婴传递。采用实验室培养鉴定、菌株水平宏基因组学和表型微阵列分析等方法，从M8菌粉以及母乳和粪便样本中检测和回收M8同源株。进一步分析了分离菌株的多样性、遗传变异、碳利用偏好和能力。本研究的长期目标是为益生菌干预对婴儿肠道菌群的规划提供指导，从而改善人类健康。
为了描述M8菌粉中菌株的多样性，选择了从两袋M8菌粉中分离出的24个M8克隆菌株，使用Illumina HiSeq平台进行深度测序(补充表2)。平均每个基因组产生了1139.00 Mb的高质量数据，对应于554.83-612.39倍的测序深度。与从NCBI数据库中检索到的M8参考基因组相比，除一个分离株外，所有分离株都带有SNPs。每个携带SNP的分离株的平均SNP数量为3.0个，从1个(6个分离株)到8个(1个分离株)SNP不等，这表明在M8菌粉中预先存在着菌株内多样性。
本研究共招募了11对哺乳期的健康母婴(补充表1)。试验期间，哺乳期的母亲每天摄入M8菌粉(6×1010 CFU/d)。在开始M8干预后的8-15周内，每周连续收集母亲和婴儿的母乳、粪便一次或两次(补充表1)。根据其形态特征，在所有收集的样品中分离出2800多个细菌的克隆菌落。经过16S rDNA鉴定，从11对健康母婴分离出222个乳双歧杆菌，包括28个来自母乳的分离株，148个来自母体粪便的分离株，以及46个来自婴儿粪便的分离株。这些分离株的基因组在Illumina HiSeq平台上进行了测序，以进一步进行系统发育和基因组分析(补充表3)。平均每个基因组产生了1235.54 Mb的高质量数据，对应于507.19-989.73倍的测序深度。 为了验证我们的假设，即M8是否存在通过哺乳期从母亲到婴儿的垂直传递，根据来自母婴对的222个分离株、从M8菌粉中回收的24个分离株、原始M8菌株、两个商业菌株(BB-12和V9)以及模式菌株(DSM 10140T)的1488个核心基因建立了系统发育树来重建宗族谱系(图2)。由于乳双歧杆菌的菌株间基因组相似度很高，区分M8的同源株和参与研究的母亲肠道中固有的其他乳双歧杆菌预计十分困难，因此，在本分析中设置了几个参考菌株。系统发育树显示出不平衡的拓扑结构，其中一个主要支系包括195个母婴对的分离株，这些分离株在系统发育上与M8菌粉中回收到的分离株和M8原始菌株不可分割，其余27个母婴对的分离株、BB-12、V9和DSM 10140T不属于这个支系。此外，大支系中的195个母婴对的分离株在基因组水平上与M8几乎相同，只有非常小的平均(5.2个SNPs)和最大(11个SNPs)SNP距离。这些结果表明，M8很可能是这195个来自母婴对的分离株和M8菌粉分离株最近的共同祖先，但由于缺乏没有服用益生菌粉的母亲的阴性对照组，所以也不能完全排除这195个分离株是母亲的内源性肠道菌群的一部分的可能。
这195个M8同源克隆菌株是从所有的母亲粪便样品(145个分离株；11/11)、大多数母乳样品(21个分离株；10/11)和大约一半的婴儿粪便样品(29个分离株；6/11)中分离出来的(表1)。这说明M8的同源株是从所有母婴对的母体粪便中分离出来的，并且从5对母婴的所有三种类型的样本中都有明显的回收。
a括号中显示了各自的粪便样品中同源M8的宏基因组组装基因组数量。b-表示未检测到。
图2 基于乳双歧杆菌250个基因组的核心基因构建的系统发育树。该树是用最大似然法，利用250个基因组的1488个核心基因的DNA序列经过1000次自举迭代而构建的。这250个基因组包括222个母婴对的分离株(黑色)，24个M8菌粉的分离株(蓝色)，以及四个参考菌株，包括M8、BB-12、V9和DSM 10140T(绿色)。系统发育树被分成大分支(红色)和小分支(黑色)。大分支中的分离株在系统发育上是不可分割的，其中包括195个来自母婴对的分离株，所有24个来自M8菌粉的分离株，以及M8原始菌株。小分支包括27个来自母婴对的分离株、BB-12、V9和DSM 10140T。(原文图1)3宏基因组学证实了M8从母亲到婴儿的垂直传递对摄入M8菌株4周和8周后收集的母体和婴儿粪便样本进行了深度测序。通过MetaSPAdes(补充表4)共组装了16个高质量的乳双歧杆菌基因组。接着使用上述相同的方法和参数设置，利用已有的250个基因组和新增的16个基因组构建了第二个系统发育树(图3)。将这些MAGs纳入数据集后，核心基因的数量从1488个减少到1271个。
第二个系统发育树的拓扑结构与第一个高度相似(图2)，包括一个大分支和一个小分支。有13个MAGs分布在大分支上，从M8菌粉和母婴对中分离出来的M8和M8同源株在系统发育上是不可分割的，这表明它们与M8菌株的同源性很高。其中有5个和8个MAGs分别从3个婴儿和5个母亲粪便样本的宏基因组中组装而成。在这种情况下，通过宏基因组学分析获得的结果与传统培养和分离获得的结果基本一致，尽管在大多数母婴对中，实验室培养方法回收的克隆株数量比MAGs要多。有一个例外是在Q家庭的婴儿粪便中没有分离出与M8有关的克隆株，但宏基因组学分析却得到了两个MAGs。
图3 基于乳双歧杆菌的266个基因组的核心基因构建的系统发育树。该树是通过最大似然法，利用266个基因组的1271个核心基因的DNA序列经过1000次自举迭代而构建的。这266个基因组包括16个宏基因组组装基因组(MAGs；前缀为：“meta”，棕色)，222个母婴对的分离株(黑色)，24个来自M8菌粉的分离株(蓝色)，以及四个参考菌株，包括M8、BB-12、V9和DSM 10140T(绿色)。系统发育树被分为大分支(红色)和小分支(黑色)。大分支中的分离株在系统发育上是不可分割的，包括13个MAGs，195个来自母婴对的分离株，24个来自M8菌粉的所有分离株，以及M8原始菌株。小分支包括3个MAGs，27个母婴对分离株，以及BB-12、V9和DSM 10140T。(原文图2)
从母婴对中分离的195个M8同源株鉴定出499个SNPs(图4A)。其中，9个SNPs在从M8菌粉和母婴对中回收的分离株中普遍检测到，包括一些高频率的变体，如M8染色体上53155、698170和777230位的SNPs。其余490个SNPs只在母婴对的同源株中发现，包括非编码区的69个，以及100个同义变体和321个非同义变体(补充表5)。 超过91%的SNPs(450个SNPs)只在一个分离株中被识别，表明它们是随机变异。相反，非同义突变似乎不均匀地分布在与代谢有关的功能基因上，特别是碳水化合物和氨基酸的运输和代谢(图4B)。在母婴对的分离株中检测到的SNP明显多于M8菌粉的分离株(P0.01)，而在母体粪便、婴儿粪便和母乳中没有发现明显的差异，这意味着突变主要发生在母亲身上(图4C)。 此外，相对较高比例(20/321；6.23%)的非同义突变主要集中在glcU基因，这是一个长度为960 bp的基因，编码一个葡萄糖转运蛋白(M8PIadj_1109，在M8菌株染色体上的位置：1259472到1260431)。通过PCR验证了检测到的非同义变体。结果为，这些变体只在母婴对的分离株中发现(8个母婴对的195个分离株中的96个；分别来自母亲粪便、婴儿粪便和母乳的77个、15个和4个分离株)，但在24个M8菌粉相关的分离株中没有发现这些变体(图4D；补充表6)。尽管该基因在20个不同的位置出现了非同义突变，每个分离株只在一个位置出现了突变，但这些突变优先发生在一些特定的位置。例如，在基因组的1260085和1260332的位置分别检测到20和29个突变，这些突变的频率明显高于其他位点(图4D)。
除glcU外，在母婴分离株中还发现了一些高频突变位点(补充表5)。在前六个高频突变位点中，有五个以上的分离株出现了点突变，包括四个非同义突变、一个同义突变和一个基因间区域突变。来自五对母婴的18个分离株(分别来自母亲粪便、婴儿粪便和母乳的11个、1个和6个分离株)在基因组700045的位置发现了非同义突变，该突变位于一个磷脂酰甘油赖氨酸转移酶编码基因上，其基因产物负责赖氨酸-磷脂酰甘油的生物合成。另外三个非同义突变(在基因组的203327、424251和1916533位置)分别在母亲粪便、婴儿粪便和母乳的6个、8个和6个分离株中被发现。这三个突变分别位于编码支链氨基酸ABC转运蛋白底物结合蛋白、3-脱氧-7-磷酸庚二酸合成酶和溶解性转糖酶的基因上，这些突变是否与适应环境有关需要进一步研究。
图4 在母婴对的M8同源株中单核苷酸多态性(SNPs)的鉴定。(A)M8的染色体中SNP的分布。图中从下到上的白色和灰色条纹分别代表M8菌粉(Powder)、B、D、F、G、L、J、Q、S、N、T和X(家族)的分离株。(B)非同义SNPs在18个直系同源基因簇(COG)功能类别中的分布。水平坐标下面的字母代表功能类别。[G]碳水化合物的运输和代谢；[R]一般功能预测；[E]氨基酸的运输和代谢；[L]复制、重组和修复；[P]无机离子的运输和代谢；[M]细胞壁/膜/包膜的生物合成；[J]翻译、核糖体结构和生物合成；[S]未知功能；[K]转录；[C]能量产生和转换；[F]核苷酸的运输和代谢；[H]辅酶的运输和代谢；[T]信号传导机制；[O]翻译后修饰、蛋白质周转、分子伴侣；[I]脂质运输和代谢；[V]防御机制；[D]细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割；[Q]次生代谢物的生物合成、运输和分解。(C)从M8菌粉和母婴对样本(母体粪便、母乳、婴儿粪便)中分离出的SNPs数量。数据以平均值±SEM表示，P值通过t检验产生。(D)在glcU基因中SNPs的分布与它的染色置有关，该基因的所有SNPs均为非同义突变。(原文图3)
由于相当一部分非同义突变发生在与新陈代谢相关的基因上，特别是glcU，因此我们研究了突变体的碳源利用能力的变化。使用Biolog Phenotype MicroArray将7个glcU突变的分离株(G4M3、G9C4、G7R82、T6M7、T12M12、T16C12和T16C15，来自两对母婴)的95种常规糖和有机酸的碳利用效率与未出现glcU突变的M8干粉的几个分离株(M8-1、M8-3和M8-6)进行了为期72小时的比较(图5A；补充图1)。当测试不同的碳源时，三种M8菌粉相关的分离株对大多数碳源的利用效率是高度相似的，这反映在它们高度相似的呼吸动力学曲线模式上。相反，与非突变的分离株相比，突变的分离株在对不同碳源的生长反应中表现出明显的差异。在碳利用曲线中观察到一个特别的聚类模式(图5A)，该模式表明与T家族和M8菌粉相关的分离株相比，G家族的三个突变体分离株在碳利用方面的相似性更高。T家族的4个突变体分离株和M8菌粉相关分离株分别形成了两个亚群，表明这两组分离株的碳利用能力存在明显差异。这些结果表明，与非亲属关系的分离株相比，来自同一母婴对的分离株具有更相似的碳利用偏好性。
12种特定碳源的细菌生长动力学曲线，包括基础底物(α-D-葡萄糖和α-甲基-D-葡萄糖苷)和有机酸(富马酸、α-酮丁酸、α-酮戊酸、丙酮酸、L-丙氨酰胺、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-缬氨酸加L-天冬氨酸、水杨酸和肌苷)。与M8菌粉相关的分离株相比，突变体分离株达到稳定期所需的时间更短(如α-D-葡萄糖)并且在监测期间/结束时AUC更大(如L-丙氨酰胺、α-酮丁酸、α-酮戊酸和丙酮酸)，这说明突变体分离株的生长明显更好(图5B)。此外，在一些底物(如富马酸、α-酮丁酸、α-酮戊酸、丙酮酸和L-丙氨酰胺)的生长曲线中很难确定经典的细菌生长模式，因为缺乏明显的迟缓期和未能达到稳定期，表明生长不理想。然而，观察到大多数突变体分离株在这些底物中生长时表现出更强的信号，这意味着它们分解和利用底物的能力增强，而这些底物通常不被没有glcU基因突变的分离株优先使用。在这12种碳源中生长时，突变体分离株的总体AUC比M8菌粉相关分离株的AUC大(P0.05，方差分析；图5C)，表明相对于非突变体来说，这些底物增强了突变体分离株的生长。这些结果表明，glcU的非同义突变确实提高了碳代谢能力和利用通常不太偏好的有机酸底物的效率。
图5 在Biolog AN微孔板上进行的表型微阵列分析中，携带glcU基因变异的突变体与没有变异的突变体的碳源利用效率的比较。(A)10个分离株(7个含有glcU基因非同义突变的母婴对分离株：G4M3，G9C4，G7R82，T6M7，T12M12，T16C12，T16C15；以及3个没有glcU基因突变的M8菌粉相关分离株：M8-1，M8-3，M8-6)在每种底物下呼吸动力学曲线的曲线下面积(AUC)聚类热图。聚类分析是通过非加权组平均法(UPGMA)进行的，比色刻度尺代表AUC，较高的数值代表较大的AUC。(B)10个分离株的12个不同代谢碳源的呼吸动力学曲线。时间(h)和观察到的代谢信号(OmniLog)分别在X轴和Y轴上表示。(C)含有glcU突变的母婴对分离株(glcU突变体)和没有glcU突变的M8干粉相关分离株(非glcU突变体)之间利用12种碳源的代谢能力差异。数据以平均值±SEM表示，P值通过t检验产生。(原文图4)
本研究验证了母体摄取的细菌通过哺乳传递到婴儿肠道的假说。选取11对健康母婴，哺乳期母亲每日服用M8菌粉，每周采集产妇粪便、母乳和婴儿粪便样本，使用传统培养方法和高通量测序方法回收生物标志物M8菌株。这项工作通过追踪母亲干预后的母乳和粪便样本中的生物标志物M8菌株，提供了直接和菌株水平的证据。菌株内多样性和代谢表型分析进一步表明，这些细菌能够最终靠基因组多态性，特别是glcU基因的多态性来适应新的环境生态位。 该研究结合了传统培养方法和高通量测序，确认了M8在母体摄入后的垂直传递。由于没有预料到样品中会存在大量的目标细菌，因此菌株的恢复和鉴定具有挑战性，并已成为概率事件。为了最大限度地恢复M8同源株，每天摄入的M8量相当高(6×1010CFU/d)，高剂量益生菌的应用是提高目标菌株检测的关键。事实上，在我们的初步研究中，使用了标准每日剂量(1×1010 CFU/d)，仍然可能发生M8的垂直传递，但恢复的M8同源株的数量没有统计学意义(数据未显示)。除了增加益生菌的剂量外，还花了大量的精力挑选克隆体进行进一步的测试，人工采集和培养的克隆菌落超过2800个，其中只有222个被确认为乳双歧杆菌。从所有11个产妇粪便样本和大多数母乳样本中成功恢复M8克隆的结果表明，我们的程序是有效，技术是正确的。同样，尽管通过深度测序获得了大量的宏基因组数据(每个样本约50 G，即常规宏基因组研究的10倍)，但仅从少量家庭的样本(分别为5个和3个家庭的产妇和婴儿粪便样本)中成功组装了M8同源MAGs。这些结果一致表明，样品中只有极少量的M8同源株存在，在某些情况下，它们可能在所用方法的检测范围内。 这项工作的开展时间与COVID-19开始时间有部分重叠，仅招募了11对处于哺乳期的健康母子完成研究。由于招募的参与者数量较少，未服用益生菌的阴性对照组未纳入研究设计，因此，未摄入益生菌受试者的粪便和母乳样本中乳双歧杆菌的基线成分剖面无法与食用益生菌粉受试者的数据进行比较，从而削弱了本研究的结论。然而，所有母亲的粪便样本都对M8同源株呈阳性，因为她们在这项工作过程中每天都摄入大量的活性M8。从大多数母乳样本中提取的M8同源株的频率较高(10/11；90.9%)，强烈支持口腔-肠道-乳腺细菌易位途径的存在，而细菌易位的类似机制也曾被提出。毫无疑问，母乳中存在微生物群，但母乳菌群对婴儿肠道定植的影响仍然是一个尚未解决的问题，这能够最终靠同时跟踪婴儿粪便样本中的M8同源株来部分回答。首先，大多数母婴均含有M8同源株(培养克隆和/或MAGs)，在这种情况下可以合理地假设M8同源株通过摄入母乳进入婴儿肠道。其次，4对母婴在母亲粪便和母乳样本中含有M8同源株，而婴儿粪便中没有。婴儿粪便中阳性克隆的缺失可能仅仅是由于目标细菌的缺乏，或确实是由于生物学原因，导致了M8同源株在这些个体的肠道中无法生存和/或定植。事实上，在几乎所有母婴的母乳样本中，只有少量阳性克隆被检测到，这表明M8同源株仅以极低的丰度存在。此外，本研究中采用细菌检测的“筛选”策略也比较繁琐。本研究的生物标记菌株是乳双歧杆菌，该亚种的菌株高度保守，菌株间基因组相似性非常高，这使得在参与试验的母亲肠道内固有的M8同源株和相似株之间很难区分。此外，应用的M8菌株没有携带任何独特的标记来帮助从其他高度相似的菌株中区分出来，并且鉴于本试验的性质，不可能引入外源性遗传生物标记来实现这一目的。另一方面，本例的垂直传递也有可能是通过口腔-肠道-乳腺途径以外其他尚未确定的途径。 大量分离的M8同源克隆的基因组进行了适应人类肠道环境的变化，这是通过对它们的多样性和碳利用偏好和能力的分析揭示的。虽然24株M8菌粉相关菌株确实表现出SNPs和菌株内多样性，但其SNPs数量和多样性明显低于母婴分离株。母婴分离株所采用的SNPs主要发生在与碳水化合物及氨基酸运输和代谢相关的基因中，这表明了基于基因组学的代谢适应在营养/碳的获取和利用中更好地生存。这种推测得到了glcU基因非同义突变的支持，该基因编码负责葡萄糖摄取的糖转运体。在195个母婴分离株中，该基因的突变频率高达49.2%，在8对母婴中检测到这种基因，暗示了极强的定向选择压力。对这些突变体的碳利用的表型分析一致显示，与那些在glcU基因中没有SNP的突变体相比，它们的代谢/生长速率显著提高。此外，突变菌株利用12种常见碳源(如富马酸、肌苷和缬氨酸)的能力显著提高，显示出广泛的代谢谱。这种代谢变化更符合人体肠道菌群的特点。因此，为了提高竞争力和生存能力，M8菌株在进入母体肠道后，很可能受到环境驱动，扩大其代谢库，以提高其利用其他细菌发酵产生的中间产物作为碳源的效率，特别是双歧杆菌和肠道菌群之间经常发生代谢叉摄食。 双歧杆菌是最早的人类肠道定植者之一，它们拥有特定的碳水化合物代谢酶，而这些酶在人体中是不存在的，它们有助于分解母乳中的寡糖，促进营养物质的消化和吸收。之前的一项研究表明，在早期婴儿中定植双歧杆菌的比例越低，在随后的生活中肠道菌群失衡的可能性就越高。此外，双歧杆菌在新生儿体内有助于维持免疫稳态，抑制过度免疫反应。因此，适当补充双歧杆菌对新生儿的短期和长期健康都有好处，与直接补充益生菌相比，母亲通过母乳喂养摄入双歧杆菌无疑更安全、更有效。
本研究以M8作为生物标记菌株，研究表明，母体摄入少量的细菌可以通过口腔-肠道-乳腺途径转移到婴儿肠道，这表明通过哺乳用双歧杆菌和其他益生菌喂养婴儿是可行的。关于垂直传递途径及其潜在应用的许多问题仍有待回答，例如，这些是否是母婴细菌传递的唯一途径和细菌易位的确切轨迹，为什么在细菌定植的结果中观察到个体差异，在进入该途径并最终定植婴儿肠道的过程中是不是真的存在物种/菌株偏好/特异性，摄入的益生菌数量和检测到的数量之间是否存在相关性，以及如何提高这一过程的效率。尽管如此，我们的研究结果为母乳菌群对婴儿肠道定植的影响以及为新生儿补充益生菌的替代方法提供了见解。